本篇文章給大家談談pcr技術的模板和原料是什么，以及pcr技術的模板和原料是什么樣的對應的知識點，希望對各位有所幫助，不要忘了收藏本站喔。

本文目錄一覽：

• 1、什么是PCR檢測？他的原理是什么？需要什么材料？
• 2、pcr要加入什么原料 是否需要RNA引物
• 3、pcr都需要什么原料

什么是PCR檢測？他的原理是什么？需要什么材料？

聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。

PCR技術簡史

PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。

PCR的實現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。

PCR的改進與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發(fā)生模板和引物之 間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫(yī)學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的 60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效 率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應用。

PCR技術基本原理

PCR技術的基本原理 類似于DNA的 天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%， 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應”，這種效應稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素。大多數(shù)情 況下，平臺期的到來是不可避免的。

PCR擴增產(chǎn)物 可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所 結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒 有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結合。引物在與新鏈結合 時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的 “短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

PCR反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液 10ul

4種dNTP混合物 各200umol/L

引物 各10～100pmol

模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。 SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接 用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。

溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR失敗。

②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

PCR反應特點

特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結合；

②堿基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。 PCR擴增產(chǎn)物分析

PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增 ，其結果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。

凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產(chǎn)物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。

瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。

酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。

分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

斑點雜交： 將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。

pcr要加入什么原料 是否需要RNA引物

無明顯同源性.

引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會.

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應, 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少.

dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性.dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到7.0～7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存.多次凍融會使dNTP降解.在PCR反應中,dNTP應為50～200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配.濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量.dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低.

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本. SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作為模板用于PCR反應.一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接 用于PCR擴增.RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜.Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產(chǎn)物減少.

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù).

溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點.在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).

①變性溫度與時間：變性溫度低,解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,若低于93℃則 需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會導致PCR失敗.

②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發(fā)生結合.由于模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞.退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長 度.對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合,提高PCR反應的特異性.復性時間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結合.

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時, DNA合成幾乎不能進行.

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合.PCR延伸反應的時間,可根據(jù)待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的.3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min.延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn).對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些.

循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度.PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度.一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多.

PCR反應特點

特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結合；

②堿基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性.

其中引物與模板的正確結合是關鍵.引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的.聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度.再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高.

靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平.能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌.

簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2～4 小時完成擴增反應.擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣.

對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板.可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測. PCR擴增產(chǎn)物分析

PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增 ,其結果是否準確可靠,必須對其進行嚴格的分析與鑒定,才能得出正確的結論.PCR產(chǎn)物的分析,可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法.

凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳,EB溴乙錠染色紫外儀下觀察,初步判斷產(chǎn)物的特異性.PCR產(chǎn)物片段的大小應與預計的一致,特別是多重PCR,應用多對引物,其產(chǎn)物片斷都應符合預訐的大小,這是起碼條件.

瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠,供檢測用.

聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好,條帶比較集中,可用于科研及檢測分析.

酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內切酶的位點,用相應的酶切、電泳分離后,獲得符合理論的片段,此法既能進行產(chǎn)物的鑒定,又能對靶基因分型,還能進行變異性研究.

分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù),也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法.

Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記后做探針,與PCR產(chǎn)物雜交.此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用于科研.

斑點雜交： 將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內部寡核苷酸探針雜交,觀察有無著色斑點,主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析.

核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可

pcr都需要什么原料

pcr需要的原料有：物(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

擴展資料：

PCR反應特點：

一、特異性強

引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。

二、純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

三、簡便、快速

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

參考資料來源：百度百科—PCR

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